wolne rodniki ,enzymy antyoksydacyjne, proces peroksydacji lipidowej

Wolne rodniki to są atomy , cząsteczki lub jony które posiadają na swojej ostatniej orbicie jeden niesparowany elektron. Są to struktury bardzo reaktywne chemicznie, jedne mniej inne bardziej, mogą dyfundować na różne odległości, nawet dalsze od miejsca powstania. Mają relatywnie krótki okres półtrwania , i proszę państwa powstają w całej gamie przemian biochemicznych, które państwo tutaj widzicie. Tutaj wolne rodniki państwo widzicie, przykłady takich reakcji między innymi w wyniku 4-elektronowej redukcji cząsteczki tlenu w łańcuchu oddechowym, warunek fizjologiczny, 4-elektronowa redukcja cząsteczka tlenu powoduje powstanie w 90-95% cząsteczek wody, natomiast te 5% to są wolne rodniki tlenowe. Natomiast jeśli sytuacja jest patologiczna, czyli np. w wybuchu – stresie tlenowym, wybuchu komórek fagocytarnych stanu zapalnego, te proporcje są odwrotne, czyli proszę państwa około 95% jest przekształcane do wolnych rodników tlenowych, natomiast pozostałe parametry do cząsteczki wody czyli około 5 – 7%. Ale proszę państwa oprócz utleniania biologicznego w łańcuchu oddechowym wolne rodniki mogą powstać w całej gamie reakcji enzymatycznych które są katalizowane np. przez peroksydazę???? aldehydową, w procesach przemiany kwasu arachidynowego jakie następują w płytkach krwi, w autooksydacji substancji biologicznie czynnych np. epinefryny, leukoplazminy , pochodnych tiolowych. Wolne rodniki proszę państwa ale i produkty ich przemian mają wpływ na fizjologie komórki, mogą mieć wpływ na uszkodzenie struktury DNA, na pękanie chromosomów, mogą mieć wpływ na depolimeryzacje kwasu hialuronowego, na tworzenie nieprawidłowych wiązań krzyżowych w kolagenie i elastynie na inaktywacje enzymów na uszkodzeni struktury błon komórkowych, Również w warunkach patofizjologicznych, mamy do czynienia z sytuacja taką, gdzie działanie czynników środowiskowych, może wpłynąć na rozprzestrzenianie się reakcji wolnorodnikowych, czyli może to mieć miejsce w przypadku np. działania dymu tytoniowego, działania pewnych parametrów chemioterapeutycznych np. toksyrubicyny??? gleomecyny, w zespole niedokrwienia przetleniania reperfuzji??? a także proszę państwa podczas przechowywania organów do przeszczepów.
Jeżeli chodzi o wolne rodniki mogą powstać endogennie, egzogennie lub mogą być to płynne produkty peroksydacji lipidowej, będą nas dzisiaj interesowały reaktywne formy tlenu. Nadtlenek wodoru, tlen singletowy, rodnik hydroksylowy,............., określa się terminem reaktywne formy tlenu. Pod spodem państwo macie jeszcze strukturę rodnika wodoronadtlenkowego , przedstawioną, to jest po prostu reakcja anionorodnika ponadtlenkowego W środowisku jonów wodorowych i ten rodnik to jest rodnik wodoronadtlenkowy. Parę zdań o każdym z tych rodników:
1. Anionorodnik ponadtlenkowy to rodnik powstający w wyniku jednoelektronowej redukcji cząsteczki tlenu , występuje w wyniku utleniania niektórych związków np. aminy katecholowej, flawiny chinony???, w różnych reakcjach enzymatycznych z udziałem oksydazy ksantynowej, cytochromu p450, w wyniku działania czynników środowiskowych. Jest unieczynniany przy udziale enzymu jakim jest dysmutaza ponadtlenkowa która przeprowadza reakcję dysproporcjonowania anionorodnika ponadtlenkowego. Ma krótki okres półtrwania, może dyfundować przez błony komórkowe, ale nie dyfunduje na tak dalekie odległości jak następny rodnik.
2. Rodnik hydroksylowy ma bardzo dużą możliwość dyfundowania przez błony komórkowe i szybko rozprzestrzenia się w kaskadzie reakcji wolnorodnikowych, jest bardzo reaktywny, równie4ż ma krótki okres półtrwania, i proszę państwa charakteryzuje go brak enzymów które by doprowadzały do jego unieczynnienia. Unieczynnienie rodnika hydroksylowego możliwe jest przy udziale takiego parametru zredukowany glutation albo witamina E.
3. Tlen singletowy może reagować z cząsteczkami w postaci dwóch parametrów na dwa sposoby innymi słowy albo przechodząc w stan tripletowy albo tworząc reakcje chemiczne odziaływując na poszczególne aminokwasy, które sobie wybitnie upodobał w strukturach białek czyli np. histydynę, metioninę, tryptofan, tyrozynę, cysteinę . Reaguje preferencyjnie z guaniną i innymi pochodnymi purynowymi, posiada działanie bakteriobójcze i bakteriostatyczne.
4. Nadtlenek wodoru wykazuje dużą reaktywność może dyfundować do miejsc w komórce uszkodzonych na dalszych przestrzeniach ale warunkuje również uszkodzenie struktur podstawowych czyli i białek i węglowodanów i kwasów nukleinowych, ma zdolność oddziaływania utlenienia grup sulhydrylowych??? białek i związków niskocząsteczkowych.
, Bardziej niż inne wspomniane rodniki zaprzyjaźnił się z grupami SH – tiolowymi.
· 4 elektronowa redukcja cząsteczki tlenu do wody – kolejne etapy chemiczne
1. tlen cząsteczkowy reaguje z elektronami i jednoetapowa redukcja doprowadza do powstania anionu rodnika ......dwutlenkowego.
2. anionorodnik ponadtlenkowy ulega kolejnemu etapowi redukcji powstaje nadtlenek wodoru
3. nadtlenek wodoru w momencie kiedy podlega kolejnemu etapowi redukcji trójelektronowej powstaje cząsteczka wody i rodnik hydroksylowy
oprócz tych reakcji istotne są tak zwane reakcje dodatkowe które również są określone jako reakcje wolnorodnikowe reakcja Tantona?? W środowisku jonów żelaza i jonów miedzi i związana jest z ich przemianą a wiele przemian biochemicznych jako koenzymy posiadają właśnie te pierwiastki w ilościach śladowych i uczestniczą tym samym w reakcji wolnorodnikowej.
-Żelazo na plus 2 stopniu utlenienia reagując z cząsteczką nadtlenku wodoru daje żelazo na plus 3 stopniu utlenienia, rodnik hydroksylowy i anion wodorotlenkowy
-Miedz z plus 1 stopnia utlenienia reaguje z nadtlenkiem wodoru i powstaje miedź na plus 2 stopniu utlenienia jon?? wodorotlenkowy i rodnik hydroksylowy
reakcja Habera – weisa?? Polega na tym że anionorodnik ponadtlenkowy reagując z nadtlenkiem wodoru w obecności jonów żelaza daje rodnik hydroksylowy, jon wodorotlenowy i tlen singletowy , lub tlen singletowy może powstać w kolejnych dwóch reakcjach
- anionorodnik ponadtlenkowy reaguje z rodnikiem wodoronadtlenkowym powstaje nadtlenek wodoru, tlen singletowy
- anionorodnik ponadtlenkowy reaguje z rodnikiem hydroksylowym i powstaje tlen singletowy i ???? Udział tych reakcji w rozprzestrzenianiu się mechanizmów wolnorodnikowych jest istotny, czyli oprócz reakcji 4-etapowej redukcji tlenu, również na powyższe dwie reakcje należy zwrócić uwagę.
Reaktywne formy tlenu oznaczamy symbolem RFT uczestniczą w całej gamie przemian biochemicznych, łącznie z podziałem komórki, agregacją płytek krwi, z metabolizmem ksenobiotyków.

Peroksydacja lipidowa

Odbywa się bez udziałów enzymów, związany jest z sytuacja taką gdzie na wielonienasycone kwasy tłuszczowe które występują w strukturach błon komórkowych, konkretnie w strukturach fosfolipidów, działają wolne rodniki są one czynnikiem inicjującym kaskadę reakcji. Generalnie proces peroksydacji odbywa się w trzech etapach.: inicjacji, prolongacji/propagacji, terminacji.
Inicjacja : musi być jakiś czynnik który zainicjuje proces peroksydacji i jego rozprzestrzenianie się, znacznym czynnikiem jest rodnik hydroksylowy który atakuje wiązania wielonienasycone następuje przegrupowanie i ???? rodnik alkilowy ten rodnik alkilowy ma zdolności reagowania z kolejną cząsteczką tlenu i powstaje rodnik nadtlenkowy, cała ta kaskada przemian powtarza się wielokrotnie – propagacja
Terminacja : albo między dwoma rodnikami nadtlenkowymi, albo rodnikiem nadtlenkowym i alkilowym albo między dwoma rodnikami alkilowymi. W wyniku reakcji terminacji powstają tak zwane dimery kwasów tłuszczowych, te dimery kwasów tłuszczowych ulegają procesowi betaeliminacji, czyli rozpadowi beta, czyli szkieletu węglowego w pozycji drugiej przy atomie węgla z którym związana jest grupa funkcyjna, i w wyniku tego procesu powstaną aldehydy, betahydroksy aldehydy, betahydroksy ketony, węglowodory a takim uznanym markerem procesu peroksydacji lipidowej jest MDA - jest to produkt określony jako dialdehyd malonowy.
Prawidłowe stężenie dialdehydu malonowego dla osobników dorosłych 3,9 – 4,5 nmol/ml
W peroksydacji występuje zjawisko reinicjacji, w pewnych warunkach reakcji jony żelaza mogą być czynnikiem inicjującym, czyli one atakują i rozpoczyna się ponowne rozprzestrzenianie się procesu peroksydacji.
Parametry enzymatyczne i nieenzymatyczne które unieczynniają wolne rodniki
Enzymatyczne – dysmutaze ponadtlenkową,katalazę, peroksydazę glutationową, i reduktaze glutationową Nieenzymatyczne – antyutleniacze, witamina E, beta-karoten, kwas askorbinowy, glutation, zmiatacze wolnych rodników czyli adrenalina, bilirubina, biliwerdyna, kwas moczowy,celuloplazmina, albumina,???? Związki biorące udział w sekwestrze??? metali jonów przejsciowych – Fe, Cu, celuloplazmina transferyna, perytyna, laktoferryna.

Jak funkcjonuja te enzymy w tej inhilacji??? wolnych rodników?

Anionorodnik ponadtlenkowy powstał w wyniku jedno-elektronoerj redukcji cząsteczki tlenu ulega reakcji dysproporcjonowania przy udziale enzymu dysmutaza ponadtlenkowa i powstaje nadtlenek wodoru. Nadtlenek wodoru może być rozkładany przy udziale dwóch enzymów : katalazy lub peroksydazy glutationowej. Jeżeli stężenie nadtlenku wodoru w komórce jest fizjologiczne czyli w normie odbywały się te wszystkie reakcje to wówczas rozkład nadtlenku wodoru związany jest z działaniem peroksydazy glutationowej (z udziałem koenzymu jakim jest zredukowany glutation), jeżeli stężenie nadtlenku wodoru jest bardzo duże to rozkłada go katalaza do wody i cząsteczki tlenu. Żeby peroksydaza glutationowa mogła prawidłowo funkcjonować to w trakcie reakcji jak zużywa ten zredukowany glutation, to ten zredukowany glutation przechodzi w formę utlenioną i ta forma utleniona musi być odtworzona , żeby cykl przemian biochemicznych mógł zachodzic. W związku z tym potrzebny jest czwarty enzym peroksydacyjny reduktaza glutationowa.
Enzym ten współpracuje ze zredukowanym fosforanem NAD-u, donorem tych równoważników w erytrocycie jest cykl pentozowy,w reakcji z reduktazą glutationową następuje odtworzenie komponentów zredukowanego glutationu i ten cykl reakcji może funkcjonować prawidłowo.

Enzymy antyoksydacyjne są:
Enzymami reakcji redoks, enzymami oksydoredukcyjnymi, zaliczanie zgodnie z unią biochemiczną do pierwszej klasy, Dysmutaza ponadtlenkowa SOD – katalizuje dysmutację do nadtlenku wodoru, posiada następujące izoformy :
cynkozależna SOD1 – cytoplazmatyczna dysmutaza , ma charakter homodimeru
manganozależna SOD2 – w matrix mitochondrialnej
EC-SOD – pozakomórkowa osoczowa dysmutaza w płynie maziowym ,w osoczu, jest odporna na działanie mocznika, wysokich temperatur, i zasad jest strukturą tetrameryczną z elementami sacharydowymi
SOD1 I POZAKOMÓRKOWA mogą być hamowane przez jony cyjankowe i jony???? Katalaza CAT – rozkłada nadtlenek wodoru do wody i tlenu występuje w peroksysomach, jeżeli takie struktury występują, w erytrocytach ich nie ma zatem na jednym biegunie znajduje się katalaza na drugim dysmutaza ponadtlenkowa i reakcje przebiegają. Jest tetramerem, Zawiera hem i................ do swojego centrum aktywnego, Posiada duży zakres funkcjonalności pH między 5 a 10,5, może oprócz w erytrocytach występować w nerce i wątrobie, charakterystyczne jest występowanie formy katalazowej – mówimy o niej cały czas(funkcja katalazowa katalazy), jeżeli w komórce jest dużo kwasów lub alkoholi, to one są utleniane do dwutlenku węgla i wody i to jest forma peroksydazowa, (funkcja peroksydazowa katalazy)
Peroksydaza glutationowa GPX – katalizuje dwa typy reakcji rozkład nadtlenku wodoru przy udziale zredukowanego glutationu do wody i powstaje tlen???? i glutation, i rozkład nadtlenków organicznych CGPX wewnątrzkomórkowa zasadnicza podstawowa w centrum aktywnym z selenocysteiną ma zdolność rozłożenia nadtlenku wodoru i ochronę przed nadtlenkiem wodoru
GIGPX wyłącznie w ścianach przewodu pokarmowego może znajdować się w wątrobie i w niektórych liniach komórek nowotworowych jej rolą jest ochrona przed nadtlenkami i ksenobiotykami czyli rozkład nadtlenków i ksenobiotyków pGPX osoczowa w płynach pozakomórkowych???? Stanowi ochrone przestrzeni pozakomórkowych
pHGPX glutationowa wodoronadtlenków fosfolipidów struktura monomeryczna i chroni błonę komórkową przed rozprzestrzenianiem się procesów peroksydacji fosfolipidowej, również w błonach mitochondriów plemników ma zdolność utleniania błony mitochondrialnej sieciując ją i przekształcając ja w skorupę twardą
reduktaza glutationowa – SSGB???? współpracuje z peroksydazą glutationową odtwarzając zredukowany glutation przy udziale NADPH który jest dostarczany z cyklu pentozowego.

Peptydy i białka – prelekcja

Peptydy są amidami aminokwasów, które powstają przez kondensację grupy karboksylowej jednego z aminokwasów i grupy aminowej drugiego. Nazywamy to kondensacją, ponieważ powstaje drobnocząsteczkowy produkt uboczny, jakim jest woda (gdyby nie to, zachodziłaby polimeryzacja). Peptydy dzielimy wg ilości aminokwasów, które wchodzą w jego składu, di- tri-, tetrapeptydy. Do 10 reszt aminokwasowych : oligopeptydy. 10-100 polipeptydy. Z alaniny i glicyny może powstać Ala-Gly, bądź Gly-Ala. Może powstać dipeptyd z dwóch cząsteczek alaniny, albo glicyny. Znamy 20 aminokwasów białkowych, dlatego ilość kombinacji jest praktycznie nieograniczona. Podaje się sekwencję polipeptydu – z lewej storny jest aminokwas z wolną grupą aminową, z prawej strony z wolną grupą karboksylowa. Koniec z wolną grupą aminową to koniec n-terminalny, ten drugi to c-terminalny. W takiej samej kolejności podaje się nazwę i sekwencję skrótami. Wiązanie peptydowe : ulega mezomerii (podobne zjawisko jak w pierścieniu benzenowym – elektrony pi są uwspólniane, tutaj elektrony pi mogą krążyć między węglem a azotem, mogąc tworzyć strukturę graniczną, cała ta struktura 3-węglowa jest płaska – co wynika z mezomerii).
Funkcje białek:
Hormonalna: oksytocyna i wazopresyna (peptydy składające się z 9 aminokwasów);
hormony tkankowe : angiotensyna, bradykinina, peptydy opioidowe, endorfiny, enkefaliny (peptydy o działaniu lokalnym, choć angiotensyna jest także związkiem o działaniu ogólnym, ma podwójne działanie) Strukturalna: kolagen, elastyna, keratyna
Kurczliwość: aktyna, miozyna
Transportowa: hemoglobina, albuminy osocza, lipoproteiny
Receptorowa: białka błonowe
Odpornościowa: immunoglobuliny, interferon
Przemiany oksydoredukcyjne : glutation (trójpeptyd, gammaglutamylocysteinyloglicyna, szczególna właściwość : kwas glutaminowy łączy się grupą gammakarboksylową)
Normalnie nie występują u człowieka, natomiast mają wpływ na niego : antybiotyki peptydowe : gramicydyna, kolistyna, bacytracyna. Toksyny węży, owadów.
Insulina i glukagon, ACTH – nie ma jednoznacznej odpowiedzi, czy to hormony peptydowe, czy białkowe, my skłaniamy się bardziej ku temu, iż są to hormony białkowe.
Najistotniejsza różnica między białkiem, a peptydem : białka mają swoją ściśle określoną konformację i tylko w tej konformacji działają prawidłowo.
Białka:
fibrylarne (alpha- i betakeratyna)
globularne
- białka proste (nie zawierają nic poza łańcuchem peptydowym : albuminy, globuliny, histony, prolaminy, protaminy, gluteiny)
- koniugowane (inaczej nazywane złożonymi, zawierają fragment niebiałkowy fosfoproteiny, chromoproteiny – zawierają barwnik, u człowieka najczęściej hemowy, glikoproteiny, glipoproteiny, nukleoproteiny, metaloproteiny)
Białka posiadają wysoce zróżnicowaną strukturę
- I-rzędowa (sekwencja aminokwasów w całym łańcuchu peptydowym; mają ją zarówno polipeptydy, jak i białka; utrzymują ją wiązania peptydowe – kowalencyjne)
- II-rzędowa (cały łańcuch polipeptydowy składa się z regularnych układów wiązań peptydowych, a reszty aminokwasowi są skierowane w bok – układ ten samoorganizuje się w strukturę alpha-helisy – stabilizacja przez wiązania wodorowe; strukturę beta-harmonijki przybiera mniejszość białek, spotyka się także pojęcie „struktura pofałdowanej kartki”; dla kolagenu charakterystyczna jest potrójna helisa, ponadto w kolagenie – odpowiada za to bardzo duża ilość proliny, hydroksyproliny i glicyny – są to aminokwasy, mają nieco odmienną budowę, niż pozostałe aminokwasy, z tego względu, że ma nieco inną budowę, między wiązaniami utrzymują się inne kąty; białko, które ma strukturę alpha-helisy może przekształcić się w beta-harmonijkę, co polega na zmianie układu wiązań wodorowych, komórka zauważając niedobór tworzy nowe białka o strukturze alpha-helisy, które jednak pod wpływem działania zmienionego w beta-harmonijkę białka same przybierają strukturę beta-harmonijki, dlatego też leczenie ludzi chorujących na choroby prionowe jest niemal niemożliwe; struktura beta-harmonijki ma dwa podtypy: przeciwrównoległy, taki, gdzie łańcuch aminokwasowy biegnie w jedną stronę, zakręca, a jego druga część zawraca w przeciwną stronę, drugim podtypem jest typ równoległy, kiedy dwa łańcuchy peptydowe stykają się blisko siebie; za budowę struktury II-rzędowej odpowiadają wiązania wodorowe między wiązaniami peptydowymi);
- III-rzędowa (konformacja natywna, jeżeli zmienić trochę układ tej przestrzeni, białko praktycznie przestaje istnieć; jeżeli zniszczymy mostki dwusiarczkowe, a następnie utlenimy grupy tiolowe, by stworzyły nowe mostki dwusiarczkowi, to mimo, że te mostki powstaną, białko nie będzie już działać; struktura ta stabilizowana jest właśnie przez mostki siarczkowe, są to wiązania silne, kowalencyjne, drugi typ oddziaływań to oddziaływania hydrofobowe, tzw. „siły Van der Waalsa“, innym rodzajem oddziaływań są “mostki solne“ – jeżeli aminokwas ma dodatkową grupę aminową albo karboksylową, to w środowisku fizjologicznego pH organizmu aminokwasy zwykle są zdysocjowane i te różnoimienne ładunki mogą się przyciągać, ostatnim typem oddziaływań są wiązania wodorowe między resztami bocznymi)
- IV-rzędowa (przestrzenne ułożenie łańcuchów, mają ją tylko niektóre białka, te, które składają się z więcej, niż jednego łańcucha peptydowego, te łańcuchy są osobno tworzone na rybosomach, a następnie składane, charakterystycznym białkem polimerycznym jest hemoglobina – tetrameryczne białko – tak samo jak dehydrogenaza mleczna)
Właściwości fizykochemiczne
-
charakter wielkocząsteczkowy (białka nie dializują w roztworach koloidalnych) -
wywierają niskie ciśnienie osmotyczne - wędrówka w polu elektrycznym, uleganie elektroforezie
- skręcają płszczyznę światła spolaryzowanego
- mają zdolność wiązania jonów
- pochłaniają światło
- są wrażliwe na podwyższoną temperaturę i czynniki denaturujące (mocznik, stężone alkohole, kwasy, jony metali ciężkich, detergenty, garbniki)
- ulegają hydrolizie (enzymatycznej przy udziale pepsyny, trypsyny, chymotrypsyny; kwaśnej – degradacji ulegają Trp, Ser, Thr; zasadowej – degradacji ulegają Arg, Cys, Thr)
Do celów analitycznych często trzeba poddać białko hydrolizie, przy użyciu enzymów proteolitycznych, kwasów, zasad, ISTOTNE JEST, że hydroliza enzymatyczna jest najskuteczniejsza i najbardziej dokładna, ponieważ nie powoduje degradacji żadnych aminokwasów, w przeciwieństwie do np. kwasu solnego, czy środowiska zasadowego.
Punkt izoelektryczny białek – pH, w którym białko ma średni ładunek równy zero. W takim punkcie nie porusza się w polu elektrycznym. W tym punkcie białko jest także najmniej rozpuszczalne, wykorzystuje się to do technik analitycznych, czy preparatywnych, wystarczy doprowadzić je do takiego punktu, a kiedy się wytrąci, odsączyć.
Białka w fizjologicznym pH posiadają reszty boczne zdysocjowane, kwaśne i zasadowe. One mogą wiązać ze sobą jony soli. Do wsalania i wysalania białek stosuje się sole nie denaturujące, np. chlorek sodu, siarczan potasu, różne sole, które nie są solami metali ciężkich. Jeżeli do białko dodamy niewielkiej ilości takiej soli, rozpuszczalność jego rośnie. Do tych grup bocznych przyłączają się zdysocjowane kationy i aniony soli nieorganicznej, ciągnąc za sobą wodę, otoczkę hydratacyjną. Ta otoczka ułatwia rozpuszczanie białek. Rozpuszczalność dochodzi do maksimum, kiedy wysycane są wszystkie reszty boczne aminokwasów w białku. Od tej pory rozpuszczalność, przy dalszym dodawaniu soli zaczyna maleć, gdyż sól tworzy wtedy własną otoczkę hydratacyjną, zabierając wodę białku. Ten pierwszy etap nazywa się wsalaniem białka, drugi – wysalanie. Proces wysolenia białka jest odwracalny, gdyż dodając sól możemy wytrącić białko, odsączyć je, a sól oddializować i mamy białko rozpuszczone. Wysalanie jest odwracalne, denaturacja nie.
Białka osocza i surowicy. W surowicy zdrowego człowieka jest od 6-8 g/dl białka, czyi 60-80 g/l. Musicie znać średnie wartości normy, nie trzeba znać zakresów (albuminy 60%, a1-globuliny 4% a2-globuliny 8% b-globuliny 12% g-globuliny 16%) Często wykonuje się rozdział elektroforetyczny i wybarwienie białka. Densytogram to wykres zależności natężenia barwy od drogi rozdziału. Nie musicie umieć rysować takiego densytogramu.
Ilościowe metody oznaczania białek (gdy będziecie opisywać metody, zwróćcie uwagę na taką kolejność : nazwa poprawna metody, krótko podstawa – co się stosuje, żadnych objętości itd., zakres metody (istotne), co zaburza daną analizę, czyli jakie składniki mogą zafałszować wynik i do czego się daną metodą stosuje w szczególności) -
metody kolorymetryczne (metoda biuretowa, stosowana na ćwiczeniach, dodawano się jony miedzi; metoda Lowriego ze względu na dodatkowy odczynnik, którym jest kwas fosfomolibdenofosfowolframowy, inaczej zwany odczynnikiem Foemina zwiększa 1000 razy czułość, metodą tę stosuję się do oznaczania rozcieńczonych roztworów białek);
- turbidymetria (istotna jest metoda Extona, stosowana do oznaczania białka w moczu i płynie mózgowo-rdzeniowym)
- spektrofotometria w UV
- metoda Kiejdahla (przyjrzyjcie się jej uważnie, ponieważ jest to metoda referencyjna wobec innych metod, czyli dzięki niej kalibruje się inne metody; pierwszym etapem jest zwęglenie próbki białka przy udziale kwasu siarkowego, cały azot przechodzi wtedy w siarczan amonu, do tego zwęglonego białka dodaje się dużą ilość wodorotlenku sodu, by oddestylować ten amoniak – cały siarczan amonu rozkłada się pod wpływem wodorotlenku, odparowuje się amoniak i jest on zbierany w kolbie destylacyjnej w roztworze rozcieńczonego k. siarkowego, w tej kolbie tworzy siarczan amonu, ale to jest rozcieńczony kwas siarkowy o znanym stężeniu (istotne) – odmiareczkowujemy nadmiar tego kwasu wodorotlenkiem sodu o znanym stężeniu, wobec czego możemy oznaczyć ile było tego siarczanu amonu i wyliczyć wobec tego ile było białka; białka osocza zawierają 16% azotu, pozostałe od 12% do 30% dla histonów -
metody immunologiczne (wcześniej omówione metody pozwalały oznaczać białko całkowite, czyli wszystkie białka w badanym płynie, metody immunologiczne pozwalają oznaczyć stężenie jednego, konkretnego białka, dlatego metody te są obe cnie bardzo popularne, można nimi oznaczać również stężenia leków, antygeny, najczęściej stosuje się metodą Elisa)
- sączenie molekularne